تعيين فاصله بين دو پرايمر  به عوامل مختلفي بستگي دارد. فاصله معمول ميان پرايمرها در سنجش‏هاي تشخيصي بين 1500-50 جفت باز مي‏باشد. حداقل عوامل مورد نياز براي انجام يك واكنش PCR  به شرح ذيل است (شكل 2):

جدول 6 ـ سيستم هاي تكثير اسيد نوكلئيك در شرايط آزمايشگاهي 

 

شكل 2 ـ اجزاء اساسي تكثير بوسيله PCR 

1) DNA يا RNA الگو

2) پرايمرها يا قطعات كوچك DNA جهت تكثير

3) چهار باز سازنده DNA يا (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) dNTPs

4) آنزيم DNA پليمراز مقاوم به حرارت مثل Taq-DNA Polymerase 

5) وجود شرايط بافري مناسب و يون Mg^{2+ .}

مراحل سيكل PCR

بطور كلي هر سيكل PCR شامل سه مرحله مي‏باشد (شكل 3) :

1) مرحله باز شدن يا واسرشت شدن دو رشته

2) چسبيدن پرايمرها به هدف

3) ساخت رشته مكمل هدف.

شكل 3 ـ واكنش زنجيره‏اي پليمراز (PCR)

برخي از عوامل موجب كاهش بازده صددرصد در هر سيكل PCR مي‏گردد. اين عوامل عبارتند از:

1) ميزان آنزيم بعد از 30-25 سيكل محدود مي‏شود

 ۲) فعاليت آنزيم پليمراز مورد استفاده در اثر دناتوراسيون حرارتي مرحله به مرحله كاهش مي‏يابد

3) رشته‏هاي هدف نوعاً دوباره به هم مي چسبند و در نتيجه غلظت آنها كاهش مي‏يابد. دوباره آنيل شدن رشته‏هاي هدف موجب كاهش چسبيدن پرايمرها به سكانس هاي مكمل خود در مولكول هدف مي‏گردد.

در نسخه‏هاي اوليه PCR ،  از قطعه كلنوو آنزيم DNA پليمراز باكتري اشريشيا كلي جهت مرحله ساخت رشته‏هاي مكمل استفاده مي‏شد. با اين حال، اين آنزيم به دليل مقاوم نبودن در برابر حرارت، در مرحله دناتوراسيون هر سيكل، از بين مي‏رفت و لذا محققين بايستي آنزيم تازه را به لوله در هر سيكل مي‏افزودند. قطعه كلنوو سكانس هاي كمتر از 200bP را به خوبي تكثير مي‏نمايد اما در تكثير قطعات بزرگتر از اين حد دچار مشكل مي‏گردد. به بيان ديگر، ميزان محصول، كم و داراي اندازه‏هاي نامتجانس مي‏گردد.

روش هاي ايجاد سيكل هاي حرارتي در PCR

چندين روش جهت ايجاد سيكل هاي حرارتي در PCR به كار گرفته شده است. اين روش ها عبارتند از:

1) سرد و گرم كردن بوسيله مايعات

2) گرم كردن از طريق مقاومت الكتريكي و سرد كردن بوسيله مايع (مثل آب)

3) گرم كردن از طريق مقاومت الكتريكي و سرد كردن بوسيله نيمه هاديها

4)      گرم كردن سطوح فلزي بوسيله نور و به دنبال آن سرد كردن بوسيله هوا

شكل 4 ـ پروفايل يك سيكل حرارتي سه مرحله‏اي 

در شكل 4، پروفايل يك سيكل حرارتي سه مرحله‏ي ديده مي شود. پارامترهاي حرارتي هر سيكل جهت انجام موفقيت آميز PCR بسيار اهميت دارد. پارامترهاي ذيل از مهمترين نكات اساسي در انجام يك واكنش تكثيري است:

- واسرشت شدن (باز شدن دو رشته DNA توسط حرارت)

- چسبيدن پرايمرها

- ساخته شدن رشته مكمل به دنبال پرايمرها

- تعداد سيكل

- زمان افزايش يا كاهش حرارت در هر سيكل

پروفايل حرارتي سيكل هاي PCR

مرحله اول : DNA دو رشته‏اي در اثر حرارت در حضور پرايمرها، چهار dNTP و DNA پليمراز مقاوم به حرارت باز مي‏شود. دناتوراسيون حرارتي بطور معمول در طيف دمايي^oC  100-93 انجام مي‏شود.

مرحله دوم : پرايمرهاي اليگونوكلئوتيدي به هدف دناتوره شده از طريق كاهش دما به ^oC 65-37 (بسته به T_m پرايمرهاي اليگونوكلئوتيدي) مي‏چسبند.

مرحله سوم : آنزيم DNA پليمراز مقاوم حرارت بدنبال پرايمرها و با استفاده از سكانس هدف، عمل پليمريزاسيون را در ^oC 72 انجام مي‏دهد. سپس اين فرآيند حداقل براي 20 سيكل ديگر تكرار مي‏گردد. در سيكل آخر، زمان پليمريزاسيون بطور معمول طولاني‏تر (چندين دقيقه) است تا سنتز رشته‏ها بطور كامل انجام شود.

آسيب حرارتي DNA ، موجب افزايش ميزان دخول نوكلئوتيد اشتباهي در تكنيك PCR مي‏گردد. البته قابل ذكر است كه اگر صحت بالا مورد نياز است لاجرم دماي بالا را هم بايد انتخاب نمود. اگر الگو، DNA سوپركويل پلاسميدي باشد نياز به چندين دقيقه جوشاندن نمونه جهت دناتوراسيون كامل مي‏باشد.

مرحله چسبيدن پرايمر، يك مرحله حساس و مهم جهت بهينه نمودن ويژگي PCR است. دماي چسبيدن پرايمر به هدف از طريق دستي يا توسط نرم افزارهاي كامپيوتري محاسبه شده و بعنوان دماي آغازين چسبيدن در آزمايشهاي اوليه بكار مي‏رود؛ با اين وجود، دماي چسبيدن مناسب پرايمرها بايد بطور تجربي به دست آيد.

ساخته شدن رشته‏هاي مكمل هدف، معمولاً در �C 72 (دماي بهينه براي فعاليت آنزيم Taq DNA polymerase ( انجام مي‏گردد. زمان پليمريزاسيون را مي توان متناسب با طول هدف مورد تكثير افزايش داد اما نكته مهم اين است كه براي اكثريت PCRها، اين زمان از دو دقيقه تجاوز نمي‏نمايد. اغلب زمان پليمريزاسيون نهايي سيكل آخر، طولاني (حدود 10 دقيقه) بوده كه موجب آسودگي خاطر از پليمريزاسيون همه مولكولهاي محصول مي‏شود.

افزايش تعداد سيكل ها موجب افزايش محصولات ناخواسته و عدم افزايش در محصول مورد نظر مي‏گردد. بنابراين در پروتكلهاي PCR معمولاً بيش از 40 سيكل به كار نمي رود. نكته ديگر اين است كه بطورمعمول از سريعترين Ramp Time در PCR استفاده مي‏شود.

مي توان در تكنيك PCR از پروتكل دو مرحله‏اي نيز استفاده نمود. در اين نوع PCR، مراحل Annealing و Extension در يك دما (حدود �C 72) و مرحله دناتوراسيون بين ^oC 100-92 انجام مي‏گردد. دماي مرحله اول مي تواند دمايي ميانه بين دماي چسبيدن و پليمريزاسيون (جهت آنزيم DNA پليمراز) باشد.

چند نكته مهم در ساليان اخير باعث بهبود تكنيكي، حساسيت، ويژگي و كاربرد بيشتر روش PCR خصوصا در تشخيص عوامل بيماريهاي عفوني نوپديد و باز پديد گرديده است. اهم اين پيشرفتها عبارتند از :

1) كشف و كاربرد DNA پليمرازهاي مقاوم به حرارت نظير DNA پليمراز Taq

DNA پليمرازهاي مقاوم به حرارت مانند Taq ، دماهاي بالا را در مرحله دناتوراسيون، در طول سيكل هاي متعدد تحمل مي‏كنند. هم چنين با استفاده از آنزيم‏هاي مقاوم به حرارت، مراحل ديگر هر سيكل يعني Annealing و Extension ، در دماي بالا انجام مي‏گيرد لذا در اثر اين دماي بالا، به ميزان بسيار زيادي تكثير غير اختصاصي كاهش مي‏يابد زيرا شرايط به شكل High-Stringency خواهد بود.

Taq پليمراز در شرايط دما و غلظت املاح در واكنش  PCR تقريباً در هر 10⁴�2 نوكلـئوتيد، مرتكب يك اشتباه مي‏شود. تنها راه جلوگيري و مقابله با اين مشكل استفاده از تعداد بيشتر رشته‏هاي الگوي اوليه و كاهش تعداد مراحل تكرار PCR و در نتيجه كاهش اشتباهات است.

2) اختراع و گسترش دستگاههاي ترموسايكلر قابل برنامه ريزي

ابداعات جديد در زمينه دستگاههاي ترموسايكلر عبارت است از :

2-1) كاربرد فورمت پليتهاي 96 خانه‏اي به جاي لوله‏هاي ميكروسانتريفوژ كه اجازه كاربرد ابزار روباتيك جابجايي مايعات را جهت تهيه نمونه ها مي‏دهد.

2-2) ترموسايكلرهاي واجد چندين بلاك، جهت انجام همزمان چندين برنامه.

2-3) ترموسايكلرهاي مخصوص جهت انجام PCR بر روي اسلايد (PCR در محل).

2-4) توسعه نرم افزارهاي باقابليت و انعطاف بالا.

2-5) كاربرد لوله‏هاي مويين شيشه‏اي به جاي لوله‏هاي اپندورف و ترموسايكلرهاي با بلاك فلزي و سيستم خنك كننده از طريق چرخش هوا بنام لايت سايكلر و كاهش زمان تكثير به 30-10 دقيقه.

3) دسترسي به معرفهاي PCR به شكل كيت جهت تشخيص عوامل عفوني نوپديد و بازپديد

4) افزايش قابل ملاحظه در دسترسي به اطلاعات ترادف ژنها و همينطور پروتئين‏ها در سيستم هاي پروكاريوت و يوكاريوت (چنانچه در عفونت نوپديد سارس مشاهده شد در كمتر از چند ماه، كل ژنوم اين ويروس ، تعيين هويت گرديد)

5) دسترسي به سنتز اليگونوكلئوتيدها با قيمت ارزانتر

6) تغييرات در پرايمرها

7)  ابداع و نوآوري در ايجاد مشتقات PCR ، مانند  RT-PCR،   Nested-PCR ، ARMS-PCR،  Multiplex-PCR،  ERIC-PCR،  و دهها روش ديگر

8) مخلوط كردن روش هاي آمپليفيكاسيون با هيبريديزاسيون و بكار گيري نانوتكنولوژي در بيوتكنولوژي، و بعبارت ديگر ابداع روش هاي GENE-CHIP يا MICROARRAY       

اضافه كردن برخي مواد در يك PCR موجب افزايش بازده و يا ويژگي مي‏گردد. با اين وجود، روش عمل مواد تقويت كننده PCR ، تا به حال به خوبي مشخص و معين نگرديده است. مهمترين سد در مورد همه اين مواد مشوق اين است كه نمي‏توان يك ماده مشخص را جهت هر PCR با يك درجه موفقيت به كار برد. برخي از اين مواد كه در غلظت خاص يك PCR را تقويت مي نمايند در PCR ديگر مشاهده مي‏شود آن اثر را ندارند. برخي از مشوقان و تقويت كنندگانPCR  در جدول )7) فهرست گرديده است.

تكثير محصول صحيح

بازده و ويژگي PCR بوسيله فاكتورهاي مختلفي تحت تأثير قرار مي‏گيرد. كيفيت DNA الگو، طراحي پرايمرها و شرايط PCR مانند غلظت MgCl₂، DNA پليمراز و شرايط بافري، همه و همه در بازده و ويژگي تأثير گذار هستند. برخي از عوامل مهم در جدول )8) آمده است.

جدول 7 ـ تقويت كننده‏هاي PCR

آشكارسازي و تجزيه و تحليل محصول PCR

محصول PCR يا آمپليكون شامل قطعه�اي از DNA ميان دو پرايمر و تكثير شده توسط پرايمر جلويي و عقبي است و داراي طول مشخصي است. به طور معمول سه نوع اطلاعات از تجزيه و تحليل فرآورده PCR به دست مي�آيد:

1) آشكار ساختن ترادف DNA  الگو و تغييرات آن

2)  مقدار محصول تكثير شده كه مويد مقادير مطلق يا نسبي DNA يا RNA الگوي اوليه است

3) تجزيه و تحليل ترداف، بوسيله تعيين ترادف مستقيم محصول يا هيبريديزاسيون با كاوشگرها.

جدول 8 ـ پارامترهاي مهم و تاثيرگذار در  بهينه نمودن PCR

در برخي روش هاي PCR، طول محصول از قبل مشخص نيست لذا بايد به روش Chromosome Walking يا RACE-PCR ( تكثير سريع انتهاهاي مكمل DNA ) اطلاعاتي را از قبل به دست آورد و سپس بر اساس اين اطلاعات ناقص، PCR را انجام داد.

محصول PCR به طور معمول كوچكتر از kbP 10 است. روش معمول جهت مشخص كردن و ديدن محصول PCR ، الكتروفورز آن در آگاروز يا ژل پلي آكريل آميد و رنگ آميزي با اتيديوم برومايد مي باشد. اتيديوم برومايد يك رنگ فلوئورسنس است و توانايي وارد شدن در DNA دو رشته اي را دارد. بعد از رنگ آميزي با اتيديوم برومايد، ژل بر روي دستگاه ترانس ايلومينيتور گذاشته و باندهاي DNA آشكار مي�شود. مي�توان از ژل عكس تهيه نمود. در ژل سايز ماركر و همين طور كنترل مثبت و منفي PCR نيز الكتروفورز مي�گردد تا بتوان هم اندازه دقيق محصول و هم صحت انجام آزمايش را اثبات نمود.

جهت ديدن محصول PCR در ژل بايد از آگاروزهاي استاندارد (DNA-grade) استفاده نمود. با اين حال، ژلهاي آگاروز با قدرت تفكيك بالا (مثلFMC Bioproducts Nusieve ) توانايي جداسازي و مشاهده قطعات KbP 2-bP 10 را دارند و جهت تفكيك بيشتر محصولات كوچك PCR، مي�توان از آنها استفاده نمود. براي محصولات كوچك از نظر اندازه، يا تفكيك بين محصولات كوچك و نزديك از لحاظ اندازه، از ژل پلي آكريل آميد استفاده مي‏شود.

محصول PCR را مي�توان از طريق هيبريديزاسيون ساترن بلات يا هيبريديزاسيون دات بلات   ، با استفاده از كاوشگرهاي راديواكتيو يا غير راديواكتيو تأييد نمود. اين دو تكنيك، حساسيت تشخيصي را نسبت به رنگ آميزي با اتيديوم برومايد افزايش مي�دهند و عنوان تست تأييدي را نيز جهت محصول PCR دارند. اگر كاوشگرهاي اليگونوكلـئوتيدي براي تشخيص محصول PCR استفاده شوند معمولاً با ³²P و انكوباسيون با [g-³²P]ATP و T4 پلي نوكلـئوتيدكيناز نشاندار مي‏گردند. البته كاوشگرها را مي توان با رنگهاي فلوئورسنت، ديگوكسي جنين ، پراكسيد از ترب كوهي (HRP)، آلكالاين فسفاتاز، استرهاي آكريدينيوم يا ديگر Tagهاي قابل آشكارسازي، نشاندار نمود.

مي�توان محصول PCR را در طي واكنش تكثيري )براي مثال با اضافه نمودن dNTPهاي نشاندار شده به مواد راديواكتيو يا فلوئورسنت يا بيوتينيله) نشاندار نمود. محصول سپس بوسيله الكتروفورز در ژل و در معرض قراردادن فيلم اشعه ايكس در مقابل آن، يا به وسيله آشكارسازي خاصيت فلوئورسنس و يا با استفاده از سيستم آشكارسازي اويدين/ استرپتاويدين شناسايي مي‏گردد.

تكثير همزمان و آشكاركردن سكانس هاي DNA ويژه، بوسيله اضافه كردن رنگهاي دخولي در DNA مانند اتيديوم برومايد در PCR، عملي مي‏باشد. مي�دانيم كه خاصيت فلوئورسنس اتيديوم برومايد در حضور DNA دو رشته‏اي افزايش مي‏يابد. از اين خاصيت مي توان جهت شناسايي محصول دو رشته‏اي بعد از تكثير استفاده نمود. تجربه ثابت كرده است كه روش هاي تكثيري را مي�توان در حضور اتيديوم برومايد با كمترين اثر منفي بر روي محصول يا ويژگي PCR به انجام رساند. بنابر اين تكثير همزمان يك سكانس DNA ويژه و آشكارسازي محصول تكثيري بوسيله مونيتور خارجي سوار شده بر روي يك ترانس ايلومينيتور مخصوص، عملي مي‏باشد. به اين تكنيك، سنجش يكنواخت گفته مي‏شود. همان طور كه ديده مي‏شود مرحله تكثير و شناسايي در اين روش از هم جدا نيستند لذا تكنيك ساده‏تر، كاربرديتر و سريعتر مي‏باشد.

تكنيك چند شكلي طولي قطعه محدود شونده (RFLP)، روشي روتين جهت شناسايي در آزمايشگاههاي تشخيصي است. در اين تكنيك سابقاً از DNA ژنوميك استفاده مي‏شد اما با پيشرفت PCR، مي توان بخش مورد نظر از DNA را تكثير و سپس Restriction Analysis را برروي محصول انجام داد )شكل 5). مزاياي PCR-RFLP عبارت است از :

1) سريعتر است.

2) به مقادير كمتري از DNA  در مقايسه با روش مرسوم RFLP نياز است.

3) DNA را مي�توان از بافتهاي مختلف استخراج نمود.

4) محصولات را مي�توان بدون كاربرد راديو ايزوتوپها آشكار نمود.

مشخصاً هضم آنزيمي محصول PCR با آنزيم‏هاي محدود كننده، تأييدي بر حضور محصول صحيح تكثير شده مي‏باشد. قطعات تكثير شده در PCR را مي�توان از طريق HPLC خالص نمود. البته اين روش به دليل پيچيدگي و گرانقيمت بودن، روشي روتين بخصوص جهت تعداد زيادي از نمونه‏ها نمي‏باشد.

چگونه مي توان از آلودگي حذر نمود

منابع بالقوه آلودگي زيادي قبل از انجام PCR وجود دارد كـه در ايـن تكنيك حسـاس خـود را نمايـان

شكل 5 ـ شمايي از PCR-RFLP

مي‏نمايد. براي مثال اگر نمونه‏هاي كلينيكي به كار رود روش هاي مناسب جهت جمع آوري و نگهداري نمونه بايد اتخاذ گردد. منشاء DNA آلوده كننده مي‏تواند سلولهاي پوست يا موي افراد، سطوح آزمايشگاه و بسياري چيزهاي ديگر باشد. آلودگيهاي قابل انتقال از طريق هوا يكي ديگر از علتهاي آلودگي نمونه‏ها است. واكنشگرها و اجزاء مورد استفاده در PCR يا مراحلي كه در استخراج و تهيه DNA يا RNA الگوي نمونه‏ها به كار مي‏رود از ديگر منابع بالقوه DNA خارجي است. براي مثال، در واكنش PCR ، اجزاء بافر، ژلاتين، پرايمرهاي اليگونوكلئوتيدي، dNTPها و حتي DNA پليمراز ممكن است آلوده گردد.

همچنين ممكن است بامشكلات ديگري از ناحيه مواد مورد استفاده در استخراج يا تهيه نمونه قبل از PCR )بطور مثال آنزيم نسخه بردار معكوس، T4-DNA ليگاز، آنزيم‏هاي محدود كننده، پروتئيناز (K مواجه شويم. نكته مهم اين است كه تمام مواد مورد استفاده در PCR بايدPCR grade  باشند يعني آلودگي با DNA نداشته باشند. مجموعه‏اي از منابع بالقوه آلودگي در جدول )9) آورده شده است.

آلودگي�هاي منفرد به سادگي قابل كنترل نيستند با اين حال كنترلهاي مختلف در هر مرحله از كار، بخصوص اگر PCR جنبه تشخيص دارد بايد انجام شود. كنترلهاي منفي جهت آزمايش واكنشگرهاي PCR از جهت آلودگي با DNA )بطور مثال DNA ژنوميك، DNA عوامل عفوني يا آلودگي�هاي ناشي از محصول قبلي (PCR بايد طراحي شود. كنترلهاي مثبت با نمونه‏هاي حاوي DNA مثبت، از نظر ارزيابي بازده و ويژگي PCR اهميت حياتي دارد. 

جدول 9 ـ منابع بالقوه آلودگي در PCR

جهت حذر از آلودگي در PCR روش هاي مختلفي را بايد اتخاذ نمود. اين روش ها برخي مشترك و برخي اختصاصي يك مرحله خاص هستند. به طور ايده‏آل، كارها بهتر است در زير  هود لامينار يا در يك آزمايشگاه مجزا، يا حداقل در يك محدوده طراحي شده براي PCR انجام شود.

وسايل و واكنشگرهاي مورد استفاده در برقراري PCR بايد جدا از وسايل عمومي آزمايشگاه باشند  و بايد از مواد مخصوص اين كار استفاده نمود. همه مواد استريل مورد استفاده در PCR بايد در يك اتوكلاو مخصوص سترون شوند و دستكشهاي يكبار مصرف و پوشش مخصوص در تمام مراحل كار استفاده شود.

واكنشگرها مانند بافر و dNTP ، بصورت batch تهيه و جهت نگهداري در اندازه‏هاي كوچك و مناسب نگهداري مي‏شود. همچنان كه قبلاً توجه شد مواد PCR-grade ممكن است آلودگي با DNA داشته باشند. حتي آنزيم Taq نيز ممكن است حاوي DNA پروكاريوت و يوكاريوتها باشد. يكي از منابع بالقوه آلودگي، محصولات PCR قبلي يا پلاسميدهاي كنترل مثبت است. اگر كنترلهاي مثبت جهت تكثير استفاده مي‏شود بايد DNA در يك محوطه ديگر به اجزاء PCR اضافه شود. نوك سمپلرها بايد حاوي فيلتر به منظور جلوگيري از ورود آئروسل به پي�پت باشند. با اتخاذ تدابير فوق، مشكل پايداري نمي‏تواند در آزمايشگاه بروز نمايد هر چند كه بايد روش هاي مخصوص جهت حذر از آلودگي PCR، در كارهاي مختلف به كار گرفته شود.

اوراسيل -N گليكوزيلاز

اوراسيل -N گليكوزيلاز (UNG) را مي توان براي رفع آلودگي از واكنشگرهاي PCR، قبل از آغاز سيكل حرارتي بكار برد، آنزيم Taq تمايل مشابهي براي dUTP بجاي dTTP دارد. بنابراين فرآورده‏هاي PCR داراي اوراسيل بجاي تيمين مي باشند و اوراسيل سوبستراي UNG است، بدين معني كه UNG پيوند -N گليكوزيديك در اسيدنوكلـئيك حاوي اوراسيل را شكسته، آن را تجزيه مي‏نمايد. بنابراين وقتي واكنشهاي PCR از قبل با UNG تيمار شود DNA‏هاي قبلي زدوده مي‏گردند ( شكل 6 ).

شكل 6 ـ روش كاربرد اوراسيل N-گليكوزيداز جهت غير فعال كردن

كاربرد اشعه ماوراء بنفش (UV)

DNA آلوده كننده در لوله‏هاي PCR را مي�توان بوسيله تاباندن اشعه UV از بين برد و مانع از تكثير آن شد. DNA خشك نسبت به محلول DNA، زمان بيشتري جهت نابودي بوسيله اشعه UV نياز دارد. عوامل مختلف ديگري در حساسيت DNA نسبت به اشعه UV تأثيرگذار است. اين عوامل عبارتند از:

�        محتواي پيريميدين )بخصوص تيميدين)

�        طول DNA هدف

�        زمان اشعه دادن

�        فاصله از منبع اشعه ماوراء بنفش (UV)

�        طول موج

�        انرژي

اشعه UV با طول موج nm 254 و انرژي mj 100 در دقيقه در مدت بيش از 10 دقيقه جهت لوله‏ها و مخلوط واكنش )بدون DNA نمونه، پرايمرها و DNA پليمراز) مورد استفاده قرار مي‏گيرد (شكل 7 ).

شكل 7 ـ مراحل مختلف غيرفعال سازي محصول PCR بوسيله اشعه UV بعد از تكثير 

تيمار آنزيمي

هضم آنزيمي با DNase I يا اگزونوكلـئاز III يا تيمار با آنزيم محدود كننده )به شرط داشتن محل شناسايي درون DNA هدف) مي‏تواند استفاده شود. اما كاربرد اين موارد موجب مراحل اضافي در PCR و تأثير در بازده آن مي�شود و حتي خود مي�تواند موجب آلودگي گردد.

تيمار با پزورالن (Psoralen)

ايزوپزورالنها مانند 4� آمينومتيل- 4 ، -5� دي متيل ايزوپزورالن(4�-AMDMIP) و 6-آمينومتيل- 4 و 5� - دي متيل ايزوپزورالن (6-AMDMIP) مي‏توانند پيوند كووالانسي با DNA دو رشته‏اي ايجاد و وقتي بطور فتوشيميايي )بوسيله اشعه ماوراء بنفش با طول موجهاي بين 400-300 نانومتر ) فعال شوند موجب تخريب DNA مي‏گردند. اين روش جهت استريل كردن در PCR مي�تواند مورد استفاده قرار گيرد. واكنشگرها را مي�توان قبل از PCR اضافه نمود و بعد از PCR، محصول از طريق فتوشيميايي فعال و منجر به تخريب DNA مي‏گردد.

DNA پليمرازها وقتي كه در معرض بازهاي تغيير يافته DNA در اين روش قرار مي‏گيرند عمل خود را نمي‏توانند انجام دهند بنابراين اگر چنين DNA هايي در لوله‏ها از قبل وجود داشته باشد و يا در حين كار وارد شود بعنوان الگو در PCR نمي‏توانند عمل نمايند.

كاربردهاي PCR

واكنش زنجيره اي پليمراز يا PCR كاربردهاي زيادي در عرصه‏هاي مختلف تشخيص مولكولي بيماريهاي عفوني نوپديد و باز پديد دارد. علت اصلي اين امر، اين است كه DNA الگوي بكار رفته در PCR را مي توان از منابع مختلف تأمين و تكثير نمود. ولي در اين مختصر نمي‏توان همه كاربردهاي اين روش را در اين ارتباط  بررسي كرد و ناگزير فقط  به برخي كاربردهاي مهمتر اين فن،  اشاره  مي‏شود.

بطور كلي PCR به پنج منظور اصلي، در اين ارتباط  به كار مي‏رود:

۱) در تشخيص عوامل عفوني نوپديد و باز پديد

2) در بررسي مقاومتهاي دارويي عوامل عفوني نوپديد و باز پديد

3) در مولكولار تايپينگ عوامل عفوني نوپديد و باز پديد

4) در تشخيص سريع و تائيدي عوامل عفوني نوپديد و باز پديد

5) در شناسايي عوامل عفوني نوپديد و باز پديد (مانند شناسايي ويروس هپاتيت C توسط مارشال در سال1989)                                                                                                         

مشكلات PCR

PCR علاوه بر تمام مزيتهايش، مشكلات مخصوص به خود را دارد؛ يكي از اين مشكلات، مساله آلودگي است. به دليل حساسيت فوق العاده و قدرت تكثير زياد PCR، هر قطعه DNA خارجي كه وارد محيط PCR شود، مورد تكثير قرار گرفته و نتايج عجيب و دور از واقعيتي ممكن است به وجود آيد. حساسيت اين روش ايجاب مي كند كه مراقبت شديدي اعمال گردد تا به اين وسيله از تكثير آلوده كننده‏هايي مانند DNAهاي تكثير شده از آزمايش هاي قبل جلوگيري به عمل آيد.

گاهي نيز باقيمانده قطعات DNA حاصل از تكثير DNA هاي قبلي باعث آلودگي PCR مي‏شود كه در اين مورد شستشوي زياد و دقيق مشكل گشا است. ولي با تمام نكات گفته شده فوق براي جلوگيري از اشتباهات احتمالي در PCR، همواره بايد كنترلهاي مثبت و منفي در هر سري از آزمايشها وجود داشته باشند. همين طور قراردادن پيپت‏ها در جايي مطمئن، استفاده از سرپيپت‏هاي فيلتردار و تقسيم محلولها و مواد به مقادير كوچكتر، اقداماتي مفيد در اين جهت است.

در يك آزمايشگاه PCR، رعايت نكات ويژه اين آزمايشگاه بسيار مهم است زيرا در صورتي كه آلودگي در سيستم PCR ايجاد شود حذف آن بسيار دشوار، پرهزينه و وقت گير خواهد بود.

يكي از منابع آلودگي اصلي در آزمايشگاه PCR مربوط به محصول PCR است كه از طريق تانك الكتروفورز و دستگاه UV به نقاط ديگر آزمايشگاه منتقل مي‏شود. پس از انجام الكتروفورز، بافر موجود در تانك الكتروفورز يك منبع بسيار قوي آلودگي است و چنانچه قطره كوچكي از آن در محيط آزمايشگاه يا اطراف تانك بريزد و خشك شود ذرات آئروسل حاصل از آن تا مدتها باعث آلودگي فضاي آزمايشگاه و مثبت شدن كاذب واكنشهاي PCR خواهد شد. اين مساله معمولاً هنگامي اتفاق مي‏افتد كه ژل آگاروز از تانك الكتروفورز به دستگاه UV منتقل مي‏شود. بنابراين، اين دو دستگاه بايد در حداقل فاصله از يكديگر و ترجيحاً در كنار يكديگر و در فضاي ويژه‏اي كه داراي لامپ UV و هواكش است، باشند و رفت و آمد در اين فضا با تعويض كفشها و روپوش صورت گيرد.

هر محصول واكنش چند ميكروليتري PCR مي تواند استخري با 15000  گالن آب را آلوده نمايد. اين مقدار در روش Nested PCR به 30000 گالن مي‏رسد. اين به اين معني است كه پنج ميكروليتر از اين حجم آب مي تواند در PCR جواب مثبت كاذب ايجاد نمايد. بنابراين واضح است كه براي جلوگيري از بروز نتايج مثبت كاذب و آلوده شدن سيستم PCR بايد اقدامات قاطع و دقيقي انجام پذيرد. مواردي از اقدامات اوليه مورد نياز عبارتند از:

�  در هنگام آزمايش نمونه‏ها از دستكشهاي يكبار مصرف استفاده شود و اين دستكشها پس از هر مرحله تعويض گردد

�  نمونه‏هاي كلينيكي و نمونه‏هاي DNA استخراج شده در فريزر جدا از محل نگهداري كيتها و مواد مربوط به PCR نگهداري شود

�  دماي آزمايشگاه بايد 20 الي 25 درجه سانتيگراد باشد و دماي فريزر و يخچال با نصب جدول ثبت دما كنترل گردد.

فضاي مورد نياز براي آزمايشگاه PCR شامل سه فضاي كاملاً مجزا است كه بايد توسط موانع فيزيكي از يكديگر جدا باشند و ورود و خروج به هر يك از اين فضاها با تعويض كفشها و روپوش انجام گيرد. اين فضاها و تجهيزات مورد نياز آنها عبارتند از:

تجهيزات مورد نياز

1) فضا جهت كار با نمونه‏هاي كلينيكي و استخراج DNA و RNA كه داراي لامپ UV و هود لامينار باشد، اين فضا بايستي كاملاً جدا از فضاي آماده سازي واكنشهاي PCR و الكتروفورز باشد. لامپ UV دو ساعت قبل از شروع كار و دو ساعت بعد از آن روشن شود. تجهيزات اوليه مورد نياز اين مكان عبارتند از:

�        سمپلرهاي مخصوص اين فضا از حجم 5 تا 1000 ميكروليتر

�        ميكروفيوژ 12000 دور در دقيقه

�        Vortex

�        تيوبها و رك مناسب

2) مكان مناسب جهت آماده سازي واكنشهاي PCR كه داراي لامپ UV و BOX بدون جريان هوا يا هود لامينار باشد. اين فضا بايد كاملاً جدا از فضاي آماده سازي نمونه‏هاي كلينيكي و الكتروفورز باشد. هيچ نوع DNA نبايد به اين فضا وارد شود. لامپ UV دو ساعت قبل از شروع كار و دو ساعت بعد از آن روشن شود. تجهيزات اوليه مورد نياز اين مكان عبارتند از:

�        سمپلرهاي مخصوص اين فضا از حجم 1 تا 1000 ميكروليتر.

�        ميكروفيوژ با دور 2000 دور در دقيقه.

�        Vortex

�        تيوبها و رك مناسب

�        فريزر �C20- و يخچال �C8-2

3) مكان مناسب براي استقرار UV transilluminator و دستگاه PCR و تانك الكتروفورز كه واجد لامپ UV و هواكش باشد. اين فضا بايد كاملاً جدا از دو فضاي قبلي باشد و ورود و خروج به آن بايد با تعويض كفشها و روپوش انجام گيرد. پس از استفاده از محصولات PCR، تيوبهاي مربوط به آنها در سطل مخصوص كه ارتباطي با فضاهاي ديگر آزمايشگاه نداشته باشد دور ريخته شود. لامپUVدو ساعت قبل از شروع كار و دو ساعت بعد از آن روشن شود. تجهيزات اوليه مورد نياز اين مكان عبارتند از:

�        سمپلرهاي مخصوص اين فضا از حجم 5 تا 40 ميكروليتر

�        ميكروفيوژ با سرعت 2000 دور در دقيقه

�        تانك الكتروفورز و منبع تغذيه برق

�        UV Transilluminator

�        سيستم عكسبرداري

�        دستگاه PCR

اين مكانها بايد از يكديگر مجزا باشند و بويژه در مكان سوم براي رفت و آمد بايد كفشها و روپوش تعويض گردد.

2-1 ـ سيستم تكثير براساس نسخه برداري (TAS & 3SR)

اولين سيستم تكثير اسيد نوكلئيك هدف غير از PCR ، درسال 1989 بوسيله دانشمندي بنام كو (Kwho)

شكل 8 ـ تكثير اسيد نوكلئيك هدف بوسيله تكنيك 3SR 

شرح داده شد )شكل 8 ). سيستم تكثير اسيد نوكلئيك براساس نسخه برداري در لوله آزمايش(Transcription based Amplification system)، يك سيستم مبتكرانه و نو مي‏باشد. بطور كلي هر سيكل TAS شامل دو مرحله است:

1)مرحله اول سنتز cDNA از مولكول RNA هدف

2)نسخه برداري در لوله آزمايش از روي اين الگويcDNAكه بطور جديد ساخته شده است.

روش عمل بدين صورت است كه در مرحله اول پرايمر مكمل هدف كه داراي دو جزء، يك قسمت مكمل هدف و يك دم كه سكانس پروموتر فاژ T_7� را حمل مي‏كند به RNA هدف مي‏چسبد.  سپس بوسيله آنزيم نسخه بردار معكوس (RT) ويروس Avian Myeloblastosis رشته مكمل DNA اين RNA ساخته مي شود. بوسيله اعمال حرارت، اين دوپلكس RNA-DNA و يا حتي DNA-DNA باز شده در عين حال RT از بين رفته و با اضافه كردن مجدد RT نتيجتاً DNA دو رشته‏اي از رشته الگو حاصل مي‏شود. اين DNA دو رشته‏اي حاصل در يك يا دو انتهاي خود حاوي پروموتر فاژ T_7� مي‏باشد. در مرحله بعد، آنزيم RNA پليمراز فاژ T_7� به اين مخلوط حاوي cDNA اضافه مي شود و در نتيجه از هر مولكول الگو بين 1000-50 عدد RNA ساخته مي‏شود ) بنابراين فعاليت يا عمل پليمراز T_7� مرحله دوم TAS را شامل مي‏شود).

RNAهاي ساخته شده در مرحله بعد بعنوان الگو براي سنتز cDNA هاي حد واسط مورد استفاده قرار مي‏گيرند. نتيجه آن حداقل 40 برابر شدن الگو در هر سيكل TAS مي باشد لذا بعد از چند سيكل اگر الگو يك مولكول هم باشد حاصل چندين ميليون برابر شدن آن است.

يكي از محدوديتهاي سيستم TAS ، نياز به مرحله دناتوراسيون حرارتي RNA-DNA در طي هر سيكل است كه نتيجه آن از بين رفتن آنزيمها و نياز به تجديد آنها بعد از حرارت دادن مي‏باشد )چون هيچ كدام از آنزيمهاي مورد استفاده در اين روش مقاوم به حرارت نيستند). به همين خاطر دانشمندان دست به كار شدند و موفق به كشف آنزيم Rnase-H اشريشياكلي شدند كه مي  تواند RNA موجود در دوپلكس RNA-DNA را هضم كند لذا نياز به دناتوراسيون حرارتي در روش TAS نمي‏باشد. لذا هر سه آنزيم موردنياز دراين فرآيند يعني Avian Myeloblastosis Virus RT , Rnase-H و T7-RNA Polymerase مي توانند بطور همزمان و در يك دما فعال باشند. اين روش تغيير يافته TAS را همانندسازي ترادف خود نگهدارنده يا (Self Sustaining Sequence Replication)3SR ناميده‏اند. چند نكته مهم در مورد تكنيك 3SR قابل بيان است:

1) تكنيك3SRتقليدي از فرآيند طبيعي همانندسازي ژنومRNAويروسها درآزمايشگاه است.

2) بوسيله تكنيك 3SR، بعد از 30 دقيقه، RNA هدف حدود 10⁸ برابر مي‏گردد.

3) اخيرا مشخص شده كه آنزيم RT ويروس Avian-Myeloblastosis داراي فعاليت ذاتي RNase-H نيز مي‏باشد لذا مي‏توان تكنيك 3SR را صرفاً به كمك دو آنزيم، يعني RT اين ويروس و T7 RNA Polymerase انجام داد.

4) عليرغم قدرت زياد اين تكنيك (3SR)، مشاهده مي‏شود كه كاربردش در چند ساله اخير

خيلي زياد نيست ولي اين روش مي تواند كاربردهاي خاصي در تشخيص و شناسايي انتخابي عوامل عفوني نوپديد بازپديد داشته باشد. بدين معني كه در RT-PCR نياز به جداسازي انتخابي RNA )بطور كامل عاري ازDNA) داريم كه بايد نمونه قبلاً با DNase عاري از RNase تيمار شده باشد و البته هميشه خطر تجزيه RNA الگو وسيله فعاليت RNase هاي موجود در نمونه وجود دارد. ولي در سيستم TAS يا 3SR، اگر DNA همراه RNA هدف باشد مسئله‏اي نيست به شرط اين كه DNA سلول هدف دناتوره نشود تا تنهاRNA هاي تك رشته‏اي هدف، قابل دسترس گردد.

3-1 ـ تكنيك ازدياد يا تكثير رشته جابجا شونده (SDA)

جديدترين تكنيك ازدياد هدف SDA (Strand Displacement Amplification)مي‏باشد)شكل9). روش عمل بدين شكل است كه ابتدا مولكول هدف دناتوره و سپس پرايمرها به ترادفهاي مكمل خود در هدف مي‏چسبند.

پرايمر مورد استفاده در SDA حاوي دو جزء است:

 

1) بخش مخصوصي كه بطور تخميني، 20-15 باز و مكمل ترادف هدف است.

2) بخش دوم، ترادف شناسايي براي يك اندونوكلئاز محدود كننده خاص در انتهاي 5� پرايمرها مي‏باشد.

 

بعد از چسبيدن پرايمرها به هدف، عمل پليمريزاسيون از انتهاي 3� پرايمرها آغاز مي‏شود. در اين روش سه dNTP عادي )مثل dATP ، dCTP و (dTTP و يك نوكلئوتيد آلفاتيو به كار مي‏رود. نتيجه اين كه محل شناسايي اندونوكلئاز بر روي DNA ساخته شده Hemiphosphorothioate مي‏شود لذا آنزيم‏هاي محدود كننده نمي‏توانند آن رشته را هضم كنند. بعبارت ديگر در اوليگونوكلـئوتيدهاي Hemiphosphorothioate شده يك اتم سولفور جايگزين يك اتم اكسيژن در پيوند فسفودي استر بين نوكلئوتيدها شده است. اين تغيير موجب مقاومت كامل اوليگونوكلئوتيد به اكثر نوكلئازها مي‏گردد.

عمل پليمريزاسيون از انتهاي 3� پرايمر و الگو انجام مي‏گيرد. سپس آنزيم محدود كننده خاص را اثر مي‏دهند كه نتيجه آن ايجاد Nick فقط در رشته حاوي پرايمر است. اين مساله باعث مي‏شود كه DNA پليمراز فاقد خاصيت ويراستاري 5��3� ، از انتهاي 3�  قسمت قطع شده شروع به عمل پليمريزاسيون با استفاده از الگوي خودش كند كه نتيجه آن جابجايي رشته جلويي مي‏باشد. فرايند ايجاد Nick ، پليمريزاسيون و جابجايي بطور پيوسته انجام مي شود كه حاصل آن ازدياد هدف مي‏باشد. 

چند نكته مهم در اين تكنيك قابل بيان است:

1) تك تك رشته‏هاي جابجا شده، خود به عنوان الگو در دورهاي بعدي مورد استفاده قرار مي‏گيرند.

2) اين تكنيك همانند روش 3SR بصورت ايزوترمال )هم دما) و همزمان انجام مي‏گيرد.

3) سيكل حرارتي در تكنيك SDA ، بدليل دناتوره شدن رشته‏ها بصورت آنزيمي، لازم نمي‏باشد.

4) يكي از محدوديتهاي تكنيك SDA ، محدوديت اندازه هدفي است كه تكثير آن مورد نظر است.

5) دومين محدوديت تئوريك تكنيك SDA ، نياز به آنزيم‏هاي محدود كننده جهت هضم DNA ژنوميك در محل هدف، قبل از فرآيند تكثير مي‏باشد.

6) سكانس هدف نبايد براي آنزيم محدود كننده مورد مصرف محل اثر داشته باشد.

 

 شكل 9 ـ اصول تكنيك ازدياد رشته جابجا شونده (SDA)

2- سيستم هاي تكثير كاوشگر يا پروب

در اين تكنيك ها برخلاف روش تكثير هدف، با اتخاذ تدابيري تعداد مولكول هاي كاوشگري كه به سكانس هدف مي‏چسبد افزايش پيدا مي‏كند. از روش هاي تكثير كاوشگر مي توان به دو روش ذيل اشاره نمود:

- تكنيك تكثير مولكولهاي كاوشگر RNA با استفاده از رپليكاز (QbRA)Qb

- واكنش زنجيره‏اي ليگاز (LCR=LAR)

1-2 ـ تكثير مولكولهاي كاوشگر RNA با استفاده از رپليكاز Qb

رپليكاز Qb باوزن مولكولي Kda215، آنزيم مسئول همانندسازي RNA ژنوميك باكتريوفاژ Qb است.  از خصوصيات استثنائـي اين آنزيم، شناسايي RNA اين فاژ مي‏باشد كه داراي ساختمان ثانويه خاصي است. اين آنزيم ساير RNA هاي تاخورده را بعنوان سوبسترا شناسايي نمي‏كند.

روش كار بدين صورت است كه ابتدا كاوشگر يا قسمت مكمل سكانس هدف را در اين RNA وارد مي‏كنند بنابراين يك بخش مخصوص هدف در اين RNA وجود دارد. در ضمن يك منطقه ديگر در اين RNA وجود دارد كه حساس به RNaseIII است و محل اثر آنزيم RNase III مي‏باشد. در عمل ابتدا مولكولهاي كاوشگر را با سكانس هدف مجاور مي‏كنند. در نتيجه بر اساس تعداد مولكولهاي هدف، تعدادي از كاوشگرها با هدف هيبريد مي‏شوند سپس RNaseIII را اثر مي‏دهند. اين RNase كاوشگرهاي غير باند شده را از بين مي برد و بعد عمل شستشو را انجام مي‏دهند. در نتيجه كاوشگرهاي غير باند شده در اثر RNase III و شستشو خارج مي‏شوند. بوسيله اعمال حرارت، كاوشگر از سكانس هدف جدا و در نهايت رپليكاز Qb اضافه مي‏شود. اين آنزيم باعث توليد تعداد زيادي از مولكول كاوشگر از روي كاوشگر آزاد شده از هيبريد پروب- هدف مي‏شود. بعد از 30 دقيقه انكوباسيون با اين آنزيم تعداد مولكولهاي كاوشگر 10⁹ برابر مي‏گردد(شكل 10).

شكل 10 ـ تكنيك تكثير كاوشگر برپايه رپليكاز (QbRAQb .

2-2 ـ واكنش زنجيره‏اي ليگاز (LCR)

اين تكنيك در سال 1989 بوسيله دو دانشمند بنام وو و والاس (Wu & Wallace)شرح داده شد. اساس اين تكنيك چسبيدن به يكديگر كاوشگرهاي اليگونوكلئوتيدي متصل به هدف با DNA ليگاز است. بدين معني كه به نمونه واجد سكانس هدف، مخلوطي از پرايمرهاي اليگونوكلئوتيدي اضافه مي‏شود. اگر سكانس هدف موجود باشد دو كاوشگر مكمل سكانس هدف به الگو مي‏چسبند و بعد اين دو اليگونوكلئوتيد به يكديگر بوسيله DNA ليگاز  متصل مي‏گردند كه نتيجه آن يك رشته كامل است. هيبريد حاصل حرارت داده مي‏شود تا دناتوره گردد و سپس سري دوم كاوشگرهاي جديد و مكمل سري اول در دماي پايين به رشته‏هاي مكمل خود مي‏چسبند. بنابراين هر سيكل LCR شامل مراحل Ligation ، Heat و Annealing است و تكرار اين سيكل موجب تكثير لگاريتمي كاوشگر مي‏گردد )شكل 11).

شكل‌  11 ـ واكنش زنجيره‏اي ليگاز (LCR)

مسائلي كه كاربرد اين تكنيك را محدود كرده است عبارتند از:

1) ميزان بالاي تكثير زمينه، ناشي از blunt-end-ligation دو جفت كاوشگر

2) نياز به اضافه كردن DNA ليگاز بعد از هر سيكل تكثير

3) زمان نسبتاً زياد واكنش )بخصوص در سيكل هاي اوليه تكثير)

4) احتمال آلودگي

5)  شرايط نسبتاً غير سخت براي مرحله Annealing كه مي‏تواند باعث زمينه زياد گردد.

جهت حل مشكلات فوق، دانشمندان موفق به كشف و جدا كردن DNA ليگاز مقاوم به حرارت از باكتري ترموس اكواتيكوس گرديدند. اين آنزيم مقاوم به حرارت دريك مرحله و در آغاز واكنش اضافه مي‏شود. بعلاوه پديده blunt-end-ligation هم به ميزان زيادي حل مي‏شود چرا كه اين پديده در دماي پايين تشديد مي‏شود و وقتي كه از DNA ليگاز مقاوم به حرارت استفاده گردد سيكل ها در دماي بالا انجام شده، كه حاصل آن كاهش blunt-end-ligation مي‏باشد.

در اين جا، ذكر چند نكته ضروري است. اين نكات عبارتند از :

1) LCR يك روش تكثير كاوشگر است نه تكثير هدف

2) در روش LCR نمي توان بطور مستقيم مولكول RNA را مورد هدف قرار داد. به عبارت ديگر اول بايد cDNA از RNA هدف ساخت و سپس اين cDNA از طريق روش هاي برپايه LCR ، قابل تشخيص و تكثير است.

3) از اين تكنيك در طي چند سال گذشته براي تشخيص عوامل بيماريزايي مثل بورليا بورگدورفري )عامل بيماري لايم)، مايكو باكتريوم توبركلوزيس) عامل بيماري سل) و ساير مايكوباكتريومها استفاده شده است.

4) LCR داراي قدرت زيادي براي تشخيص جهشهاي نقطه‏اي است.

3- تكنيك هاي تكثير سيگنال

روش ديگر در تشخيص بجاي تكثير سكانس هدف يا تكثير كاوشگر، تشديد سيگنال است. هدف اين تكنيك ها افزايش حساسيت آزمايشهاي هيبريديزاسيون )دو رگه سازي) بر اساس تكثير سيگنال از مولكول كاوشگر مي‏باشد. از نظر تئوري، به دو طريق مي توان اين عمل را انجام داد:

�  سيگنال را ازطريق افزايش چسبيدن مولكولهاي گزارشگر به مولكول كاوشگر افزايش داد

�  شدت سيگنال هر مولكول گزارشگر چسبيده به كاوشگر را تشديد نمود.

1-3: كاوشگرهاي مركب (Compound Probes)

كاوشگرهاي مركب يا پيچيده داراي دو جزء عملي هستند:

الف) كاوشگر اوليه كه سكانس هدف را تشخيص مي‏دهد و در عين حال داراي چندين محل اتصال براي كاوشگر ثانويه حاوي گزارشگر مي‏باشد.

ب) كاوشگر ثانويه كه داراي گروه يا گروههاي گزارشگر است.

در اين سيستم، كاوشگر اوليه از طريق بخش مكمل هدف به مولكول الگو متصل مي‏شود. قسمتي از كاوشگر اوليه كه آزاد است و مكمل مولكول هدف نيست در دسترس كاوشگر ثانويه قرار مي‏گيرد و كاوشگر ثانويه چون مكمل قسمت باقيمانده است به آن مي‏چسبد. نتيجه آن ايجاد يك شبكه خطي يا حلقوي از كاوشگرها است كه حاصل آن تشديد سيگنال مي‏باشد.

از مشكلات اين تكنيك، سيگنال زياد زمينه آن مي‏باشد. يكي از روش ها براي كاهش اين سيگنال زمينه، استفاده از روش تسخير مولكول هدف يا كاوشگرهاي شاخه‏اي است.

شكل12 تكنيك كاوشگرهاي شاخه‏اي براي تكثير سيگنال

2-3 ـ كاوشگرهاي شاخه‏اي (Branched-DNA Probes)

 اين تكنيك داراي چند مرحله است بدين ترتيب كه بعد از خارج كردن مولكول هدف از ارگانيسم مورد نظر، از يك كاوشگر اليگونوكلئوتيدي استفاده مي‏شود كه قسمتي از آن مكمل با سكانس هدف و بخش ديگر آن مكمل با DNAاي است كه به يك بستر چسبيده است. بعد از اتصال اين مجموعه به بستر، كاوشگرهاي سري دوم كه براي سكانس هدف اختصاصي هستند، اضافه مي‏شوند. به كاوشگرهاي سري دوم توسعه دهنده گفته مي‏شود. بعد از چسبيدن كاوشگر توسعه دهنده به سكانس مكمل هدف، كاوشگر خوشه‏اي يا bDNA اضافه و به پروب توسعه دهنده مي‏چسبد. به پروب آخري، مولتيمرتكثيري شاخه‏اي هم گفته مي‏شود. بعد از چسبيدن bDNA به كاوشگر توسعه دهنده، اليگونوكلـئوتيدهاي نشاندار شده با آنزيم آلكالاين فسفاتاز اضافه شده و به bDNA مي‏چسبند. در نهايت، سوبستراي كونژوگه اضافه و خاصيت Chemilluminescence اندازه گيري مي‏شود. حساسيت اين روش 10⁵-10³ مولكول هدف است. از اين روش براي تشخيص ويروس هپاتيت C، هپاتيت B، سايتومگالو ويروس و ايدز (HIV) استفاده شده است شكل 12.